| 北京智云達科技股份有限公司 | |
| 郵 編： | 15810687836 |
| 電 話： | 4006-099-690 |
| 網 址： | www.tech-advance.com.cn |
| 公司地址： | 北京市海淀區中關村和盛大廈 |
目前，細菌鞭毛染色方法根據染色劑的不同，可分為堿性復紅法、副品紅法、結晶紫法、維多利亞藍B法、鍍銀染色法和熒光蛋白染色法6類，前5類方法的媒染劑成分中均含有單寧酸，染色原理通常是采用不穩定的膠體溶液做媒染劑，并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛腫脹（tar and feather）”，鞭毛直徑加粗，進一步染色后即可在油鏡下觀察。
1. 堿性復紅法和副品紅法
1926年由Gray首創，其媒染液成分包括20%丹寧酸水溶液2.0ml，硫酸鉀鋁飽和水溶液5ml，飽和氯化汞水溶液2ml，3%堿性復紅乙醇（95%）溶液0.4ml，臨用前混合，且需過濾后方可使用。染片時，媒染劑染色約6min，具體時間尚需在試驗中摸索確定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸復紅染液，染片時需要1小片吸水紙蓋在涂片上，染色3min。由于該方法媒染劑混合物不穩定、操作復雜、經驗性強。Leifson于1930年建立了副品紅法，并于1938年和1951年兩次對該方法進行了改良，稱為Leifson方法。染色試劑由3種溶液組成：A為1.5%NaCl水溶液，B為3%單寧酸水溶液，C為乙酸副品紅0.9g，堿性副品紅0.3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。使用時把等體積A和B混合，然后再加2體積C與之相混。該試劑冷藏可保存1～2個月。
2. 結晶紫法，又稱Ryu法
1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等進行了改良。媒染劑：5%石碳酸10 ml，2g單寧酸和10 ml飽和硫酸鉀鋁。染色劑：飽和結晶紫乙醇溶液，即12g結晶紫溶于100 ml無水乙醇中。使用時把10份媒染劑與1份染色劑混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色試劑，采用濕片技術進行鞭毛染色，雖然可以觀察到細菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法優點是試劑比較穩定，目前Difco公司已經研制出該方法的商品試劑盒，但染色效果亦不甚理想.
3. 維多利亞藍B法
1990年由Inoue等報道日本制藥株式會社Shionogi Seiyaku研制出一種細菌鞭毛染色商品試劑盒。其試劑組成包括維多利亞藍B、苯酚、單寧酸和硫酸鉀鋁，染色約需7min。該試劑保存期約為6個月，關于其染色效果雖然有過一篇文獻評述，但卻沒有采用評分法進行評價，很難判斷其染色效果。
4. 鍍銀染色法
1958年Rhodes根據Fontana的螺旋體改良鍍銀染色法，建立了一種細菌鞭毛鍍銀染色法。試劑分為媒染劑和銀染劑。媒染液：10%單寧酸10 ml加5 ml飽和硫酸鉀鋁水溶液，再加1 ml苯胺飽和水溶液形成沉淀，通過搖動又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，穩定10 min后使用。銀染液：配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml備用，再緩慢加入濃氨水（比重0.880）使形成的沉淀剛好重新溶解，最后把備用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到搖動后呈現輕微而穩定的薄霧狀溶液為止，避光保存，可穩定數周。用媒染液染片3～5min，蒸餾水充分洗滌后，再把銀染液滴加至涂片上。加熱至接近沸騰，染色3～5min。
由于Rhodes鍍銀染色法媒染液成分復雜、操作繁鎖，所以1965年Blenden等改良了細菌鞭毛鍍銀染色法的配方。試劑A：100 ml蒸餾水中加入5 g單寧酸，1.5 gFeCl3，15%福爾馬林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。試劑B：使用2% AgNo3，其他同于Rhodes，但試劑不穩定，要求在4h內使用，并用要用氨水調pH至10。試劑A染片2～4min，試劑B染色30 s，不需加熱。
由于以上兩種鍍銀染色方法都要使用營養瓊脂斜面培養物，并且需用無菌蒸餾水懸浮菌液制片，未采用評分法評價鍍銀染色方法。因此1977年，West等對鍍銀染色法進一步改良，制備涂片時直接使用血平板，評價染色效果首次使用5分制，通過該評價方法證明了加熱銀染液染片可以提高染色效果。試劑配方：媒染液為飽和硫酸鉀鋁水溶液25 ml，10%單寧酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃保存，染色液配制同Rhodes，但需避光5℃保存。媒染液染片4min，銀染液滴加至涂片上加熱至微冒蒸汽，染色4min。同時West等還對使用不同培養基進行染色效果評價，包括半固體動力培養基、血瓊脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜面，其中半固體動力培養基和TSA斜面25℃，培養18～24h；血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h。評價結果血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h不適于細菌鞭毛染色，而半固體動力培養基和TSA斜面25℃，培養18～24h適合于細菌鞭毛染色，同時也證明了使用福爾馬林處理標本制備涂片并不能有效阻止鞭毛脫落。
由于鍍銀染色法媒染液不穩定，需避光5℃保存，1992年Porter等繼續改良該方法，其試劑配方同West等的方法，只是媒染劑避光室溫可保存數月，延長媒染劑染色時間為8 min，染色液不需加熱，只染30 s，制備涂片程序略有不同。使用TSA平板，36℃培養24h，但遺憾的是Porter等只使用了1種細菌（奇異變形桿菌）進行研究。
于是1994年Finegan等進一步證實使用過期媒染劑進行鍍銀染色可以增強鞭毛染色效果，并使用4種細菌（綠膿假單胞、奇異變形桿菌、黏質沙雷菌、枯草芽孢桿菌），用trypitcase soy肉湯及其瓊脂平板，26℃培養24h。試劑配方仍不變，媒染液放置1、2、4、8、16周后進行染色，媒染液染色8 min，銀染液染色30～60 s，不需加熱。這4種細菌均染色成功，從而證明媒染液可至少放置16周。
5、鞭毛的負染
具體操作：菌懸液，直接滴在銅網上，1－2分鐘后，吸去多余的菌液（似干非干的程度），再滴上0.1％的磷鎢酸溶液，1分鐘后，吸去多余的染液，然后就可以在電鏡下觀察了。一般染色后十五天之內看電鏡。時間太長效果不好。這是我試驗用的方法。
曾做過一段時間的細菌鑒定，以下是一些染色心得：
首先染色用玻片一定要干凈，洗液泡過之后蒸餾水沖洗干凈。涂片的時候菌千萬別涂得太多。第一部染色時，可將玻片置于水浴鍋內，溫度保持在35度,蓋上蓋（主要是保持一定的濕度，防止染色液變干不利于沖洗，這步非常有用)。一定要將第一步使用的媒染液沖洗干凈，否則影響染色效果，背景可能非常 臟。其他的步驟參考書上的資料進行，一般沒什么問題。我用這種方法染單鞭毛的弧菌，效果非常好。
注意事項：
1. 要注意培養條件和培養時間：①用點接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固體平板上接種。一般一個平板點接3～4處。經比較用半固體培養基培養出來的菌體活動度大，鞭毛長且多，易于染色，這可能與半固體培養基更適于菌體運動、鞭毛生長較好有關。用點接種法在平板上接種更易于挑取邊緣幼齡的菌體。②培養時間要嚴格掌握，一般培養9～12h較好，菌齡超過15h，鞭毛染色效果較差，這可能與老齡菌體活動度降低、鞭毛易脫落有關。
2.染色過程中的細節也應充分注意：①取菌要取菌落邊緣的幼齡菌體。②取菌后的接種環在載片上的蒸餾水中輕輕沾幾下即可，不要用力太猛，更不能用接種環大幅度涂開；將載片稍傾斜，使菌液散開即可，否則鞭毛易脫落，造成染色失敗。③鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用熱風吹干，不能熱固定，這是由于加熱后菌體易變形，鞭毛易脫落，影響觀察。④A染液染3～5 min，其后用蒸餾水（自來水效果差）沖洗時一定要充分，否則加B染液后，背景很臟，鞭毛不易被觀察到，影響實驗效果。⑤加B染液后，將玻片稍加熱（但不能太熱，更不能沸騰或蒸干）使其微冒蒸汽，30～60 s，染色效果較不加熱為好。⑥B染液染完后，用蒸餾水沖洗比用自來水沖洗效果好。
本文關鍵詞：細菌鞭毛染色的方法
